茨城工業高等専門学校の千葉薫教授、茨城大学大学院理工学研究科（工学野）の田中伊知朗教授らの研究チームは、日本原子力研究所（現：日本原子力研究開発機構原子力科学研究所）の生体高分子用単結晶中性子回折装置-3(BIX-3)を用いて、ヒトリゾチーム（130アミノ酸からなる分子量14.3kDaのタンパク質分子）の中性子結晶構造解析実験を行いました。
これまでタンパク質分子の骨格である主鎖を支えるペプチド結合は、Paulingらが調べた小さな有機化合物の中のペプチド結合と同じく、1951年以降現在まで、一様な硬さの平面構造をとると考えられてきました。プロテインデータバンク(PDB)に登録された20万個以上のタンパク質分子の立体構造解析も、原則的にはペプチド結合が平面であるという前提で行われています。しかし、本研究で行なったヒトリゾチームの中性子結晶構造解析を起点として、複数の実験手法で得られたデータを精査したところ、タンパク質の分子の中では、タンパク質分子自身が作る静電ポテンシャルなどにより作られる「タンパク質場」に引き寄せられた水素イオンまたは重水素イオンによって、ペプチド結合が個々に柔らかくなることがわかりました。本研究の結果は、タンパク質のペプチド結合は一様に硬い平面である、という、長年にわたりタンパク質の構造研究を支えてきた概念と、タンパク質の主鎖は立体構造の骨格を保ち、側鎖が機能を担う、という役割分担を見直す必要があることを示しています。
本研究成果は、アメリカ蛋白質学会(The Protein Society)発行の『Protein Science』に"Site-specific relaxation of peptide bond planarity induced by electrically attracted proton/deuteron observed by neutron crystallography"として2023年9月20日（現地時間）にオンラインで掲載されました。
研究の内容
タンパク質は、小さいものでも1000個以上の原子からなる巨大分子です。タンパク質の構造解析では、タンパク質分子を形作る各々の原子の位置(座標)を求めます。よく使われる方法は、タンパク質水溶液を使って作製したタンパク質の結晶にX線をあて、得られた回折データから原子座標を計算で求めるX線結晶構造解析です。X線のかわりに中性子を使えば、中性子結晶構造解析になります。このほかに、核磁気共鳴(NMR)法や電子顕微鏡を使ってタンパク質の構造解析を行う方法もあります。タンパク質の立体構造データを集めたプロテインデータバンク(PDB)に最も多くエントリーされているのはX線結晶構造解析で求めた原子座標データです。X線は電子で散乱するため、X線結晶構造解析では電子を持たない水素イオンや重水素イオンは観測できませんが、中性子は原子核で散乱するため、X線では観測できない水素イオンや重水素イオンの原子核の位置を観測することができます。この特長を生かして中性子結晶構造解析は、主にタンパク質の働きに重要な役割を果たす側鎖の水素を観測する実験に用いられてきました。
タンパク質の結晶構造解析も、小さな分子の結晶構造解析と同じ原理を使っていますが、原子の数が多すぎるため、実験データを解析する際、既にわかっている基本情報を与えて計算を行う点が異なります。例えば、実験試料となるタンパク質の中で、どんな形のアミノ酸がどういう順番につながっているかという情報や、C-H、C-Nなどの原子間結合距離や結合角などの情報です。「ペプチド結合は平面である」という情報もタンパク質の構造解析には必要不可欠な情報です。例外的にとても分解能の高いデータが手に入り、このペプチド結合は曲げた方がデータとよく合う、ということがわかったペプチド結合に限り、曲がってもよいとする場合がほとんどです。結晶構造解析では、たくさんの分子の平均の構造を観測するので、分子ごとにあちこちを向いている側鎖などは、平均の構造では１つの座標に決めることができません。多くの分子でこちらを向いている、ということが観測された場合のみ、そちらの方向に原子座標を置きます。タンパク質の主鎖は側鎖に比べて動きにくいので、どの分子でも同じ位置にあることが多く、結晶構造解析で比較的観測しやすいですが、主鎖の構造もはっきりわからない部分のペプチド結合は平面のままにしておくのが普通です。近年、高分解能の構造解析が行えるようになってきたため、構造解析で得られたタンパク質の分子モデルにもしばしば歪んだペプチド結合が観測されるようになってきました。しかし、これらのペプチド結合がなぜ歪んでいるか、その化学的な原因についてはわかっていませんでした。
結晶中に並んだタンパク質分子のすき間を満たす多くの水分子のうち、結晶構造解析で原子座標が決められるのは、タンパク質分子の中のある原子にひきつけられ、同じ位置に留まりやすくなったわずかな水分子だけです(図３)。さらに、X線結晶構造解析では水素はほぼ観測できないため、酸素原子がタンパク質分子にひきつけられるなどして、どの結晶格子の中でも同じ位置にあるわずかな水分子(図３Ａ、Ｅ)以外は観測されません。タンパク質の結晶の中には、このような観測できない水分子が数多く含まれています(図１Ａの空白部分にも水分子が満